С 1852 года, после отъезда Клауса в Дерптский университет, Бутлеров возглавил преподавание всей химии в Казанском университете. В 1851 году он защитил магистерскую диссертацию «Об окислении органических соединений», а в 1854 — докторскую «Об эфирных маслах» в Московском университете. В 1857—1858 годах Бутлеров совершил важнейшую заграничную поездку, посетив лаборатории Германии, Австрии, Италии, Франции, Швейцарии и Англии. В Париже, в лаборатории Шарля Вюрца, он начал цикл экспериментальных работ по производным метилена. 17 февраля 1858 года на заседании Парижского химического общества состоялось его первое публичное выступление по теоретическим вопросам органической химии.
В 1860—1863 годах Бутлеров дважды назначался ректором Казанского университета. В 1868 году по приглашению Д. И. Менделеева переехал в Санкт-Петербург и занял место ординарного профессора на кафедре органической химии Петербургского университета. В 1874 году избран ординарным академиком Петербургской Академии наук.